Dzieła Malczewskiego są w Muzeach Narodowych w Warszawie, Krakowie i Poznaniu oraz w Muzeum im. Jacka Malczewskiego w Radomiu. Ministerstwo Kultury i Dziedzictwa Narodowego nadal szuka ponad 70 jego obrazów będących polskimi stratami wojennymi.
Do najbardziej znanych obrazów należą: "Melancholia", "Hamlet polski", "Zatruta studnia" i "Błędne koło". Malczewski namalował około dwóch tysięcy obrazów. Do dziś przetrwało ich 1200. Początkowo tworzył sceny rodzajowe i szkice inspirowane utworami Juliusza Słowackiego. Z tego okresu pochodzą obrazy: "Mazepa", "Dwunastu harfiarzy z Lilli Wenedy" czy "Śmierć Ellenai". Malczewskiego inspirował także folklor, czerpał z motywów mitologicznych i biblijnych. Malował Chrystusa, anioły, harpie, fauny, chimery i ludzi, wplatając te postacie w symboliczne sytuacje czy surrealistyczne wizje. Motyw śmierci pojawiał się w jego płótnach w cyklu "Thanatos", w którym odmiennie przedstawiał greckiego boga, uskrzydlonego lub pod postacią kobiety. Centralnym punktem odniesienia sztuki Jacka Malczewskiego był jednak człowiek widziany przez pryzmat spraw ostatecznych. W dojrzałej twórczości malarza dominowała refleksja nad życiem i śmiercią. Bogatą część dorobku twórczego Jacka Malczewskiego stanowią autoportrety, wśród nich jeden z najbardziej znanych - "Autoportret z hiacyntem". Ostatni, wielki cykl malarski Jacka Malczewskiego zatytułowany "Wizja Ezechiela" został ukończony po odzyskaniu przez Polskę niepodległości. Artysta skupił się w nim na tematach, wokół których ogniskowała się jego twórczość, jak: Polska, śmierć i odrodzenie, miejsce artysty w świecie.
Jacek Malczewski angażował się w działalność pedagogiczną w krakowskiej Akademii Sztuk Pięknych, od 1912 roku do wybuchu I wojny światowej był jej rektorem. Uczył malarstwa także kobiety, które wówczas nie mogły studiować w akademii. W 1897 roku wraz z Teodorem Axentowiczem, Józefem Mehofferem i Stanisławem Wyspiańskim założył Towarzystwo Artystów Polskich "Sztuka".)